Ažurirano 07.09.2016. godine
Uvod
Malarija je najučestalija tropska bolest, sa visokim morbiditetom i mortalitetom i sledstvenim ogromnim ekonomskim i socijalnim značajem. Procenjuje se da je u svetu oko 3,2 milijarde ljudi u riziku od obolevanja od ove bolesti. Prema podacima Svetske zdravstvene organizacije u 2015. godini je bilo 214 miliona novih slučajeva malarije sa 438.000 smrtnih ishoda i transmisijom u 95 zemalja.
Iako je u poslednjih 50 godina značajno smanjena geografska teritorija zahvaćena malarijom, kontrola je sve teža. Ponovno javljanje malarije je sve učestalije u regionima iz kojih je parazit ranije eradikovan ili u kojima je incidencija bila značajno smanjena. Razlozi su mnogobrojni i uključuju globalne klimatske promene, ekološke promene pod uticajem čoveka koje favorizuju održavanje i širenje populacije komaraca, multirezistenciju parazitskih vrsta, kao i masovne migracije, izazvane konfliktima ili porastom turističkih i poslovnih putovanja iz i u malarična područja.
Malarija je izlečiva bolest ako se na vreme prepozna i dijagnostikuje. Sa aspekta sprečavanja ponovnog uspostavljanja transmisije, pouzdana i pravovremena dijagnostika predstavlja značajnu kariku u lancu prevencije.
Epidemiologija malarije
Uzročnici malarije pripadaju rodu Plasmodium (P.). Od preko 250 vrsta ovog roda samo pet je odgovorno za malariju čoveka. Biološki vektor plazmodijuma su ženke komaraca roda Anopheles (A.). Poznato je preko 400 vrsta komaraca roda Anopheles (A.), ali samo tridesetak vrsta imaju vektorski kapacitet za prenošenje malarije. Čovek se inficira ubodom zaraženih ženki komaraca kojim unose sporozoite, infektivne oblike parazita. Malarija je vezana za vodena staništa vektora, pre svega tropskih i subtropskih regiona sveta, gde visoke temperature pogoduju vektorima i obezbeđuju kompletiranje razvoja plazmodijuma u ženki komarca.
Vrste roda Plasmodium imaju različitu geografsku distribuciju i učestalost. P. falciparum i P. vivax su najšire rasprostranjene vrste, P. malariae i P. ovale ređe, dok je P. knowlesi ograničen na jugoistočnu (JI) Aziju.
- falciparumširoko je rasprostranjen u tropskim i subtropskim područjima i izaziva veliki broj kliničkih slučajeva. Najveću prevalenciju P. falciparumima u podsaharskoj Africi, Novoj Gvineji i na ostrvu Hispanjola, dok je P. vivax najzastupljeniji u južnoj i JI Aziji, Americi i zapadnom Pacifiku. Ove dve vrste su podjednako zastupljene na Indijskom podkontinentu, u istočnoj Aziji i Okeaniji.
- P.vivax ima globalnu distribuciju, jer je sem tropskih i subtropskih područja značajno zastupljen i u umerenim klimatskim područjima. Duga inkubacija (i do 8–10 meseci) objašnjava zašto ova vrsta može biti endemska i u područjima sa dugom, hladnom zimom. Procena je da godišnje od malarije izazvane ovom vrstom oboli 90– 120 miliona ljudi. Trenutno najveća ekspanzija P.vivax malarije beleži se u Severnoj Koreji, sa rizikom da se proširi na Kinu i Južnu Koreju.
Vrsta P. ovale zastupljena je u većini zemalja podsaharske Afrike, JI Azije i Indijskog podkontinenta, sa prevalencijom od čak 15% u ruralnim delovima Nigerije i Papua Nove Gvineje.
- malariae ima nisku prevalenciju ali globalnu distribuciju, koja se poklapa sa distribucijom P. falciparum.Raširen je širom podsaharske Afrike, JI Azije, Indonezije i ostrva u zapadnom Pacifiku, a u JužnojAmerici u području Amazona.
- knowlesije prvi put opisan 1931. kod dugorepih makaki majmuna u Singapuru, a prve infekcije ljudi zabeležene su 1965. i 1971. godine u Maleziji, ukazujući na njegov zoonotski kapacitet. Vulnerabilno područje za transmisiju ove vrste proširilo se iz Malezije na šire područje JI Azije i poklapa se sa distribucijom vektora. Distribucija P. knowlesiu šumskim pojasevima uslovila je importovanje ove vrste preko turista u zapadnu Evropu.
Intenzivna poslovna i turistička komunikacija sa endemskim regionima, kao i priliv imigranata, uslovljavaju brojnost importovanih slučajeva malarije, naročito u zemljama zapadne Evrope. Bitan aspekt importovane malarije je ne samo broj obolelih i umrlih, već i mogućnost ponovnog unošenja u zemlje iz kojih je iskorenjena ali u kojima su i dalje prisutni vektori.
Importovani slučajevi malarije u uslovima globalnog zagrevanja obavezuju na budnost i prevenciju. Visoke temperature stvaraju pogodne uslove za preživljavanje vektora i kompletiranje sporogoničnog ciklusa u njima preuzimanjem gametocita plazmodijuma. Slučajevi sporadične autohtone transmisije malarije zabeleženi su u pojedinim delovima Evrope, npr. u Italiji, na Korzici i u Španiji, dok je u Grčkoj ponovo uspostavljeno epidemijsko javljanje. Naime, nakon eradikacije 1974. godine godišnje je beleženo po 20–50 importovanih slučajeva. Od 1991. počelo je prijavljivanje retkih autohtonih slučajeva, a od 2009. godine uspostavljena je transmisija P. vivax u Lakoniji, području sa dosta vodnih kanala, pa je u periodu od 2009. do 2012. zabeleženo ukupno 73 slučaja (2009. – 7, 2010. – 4, 2011. – 42, 2012. – 20 slučajeva). Lokalni vektori preuzeli su P. vivax gametocite od imigranata iz Pakistana i Avganistana koji su obavljali poljoprivredne radove tokom leta.
U regionima sveta gde je malarija endemska, pojedinci mogu imati veoma niske nivoe parazitemije. Osobe koje žive u područjima endemskim za malariju kontinuirano su izložene infekciji, tako da nakon ponovljenih infekcija mogu razviti stanje preimunicije koje se karakteriše imunskim odgovorom sposobnim da kontroliše parazitemiju. Ovaj imunitet međutim ne može da eliminiše sve parazite iz cirkulacije, tako da ove osobe postaju asimptomatski rezervoari i omogućavaju zaražavanje vektora i održavanje transmisije. Ako ovakve osobe dođu u područja gde malarije nema, predstavljaju opasnost i za uspostavljanje transmisije u ovim regionima ukoliko domaći vektori preuzmu gametocite krvnim obrokom, kao i rizik za zdravstvene radnike (ubod kontaminiranom iglom), za prenošenja infekcije transfuzijom krvi, kongenitalno ili transplantacijom organa.
Epidemiologija malarije u Srbiji
U bivšoj Jugoslaviji malarija je iskorenjena 1964. godine, što je i Svetska zdravstvena organizacija (SZO) zvanično potvrdila 1974. Od tada, u Srbiji se beleže samo importovani slučajevi. Zbog prisustva importovane malarije, potencijalnih vektora i velikih vodnih prostora u priobalju Save i Dunava pogodnih za održavanje Anopheles spp., SZO je ovo područje proglasila prijemčivim za malariju.
Životni ciklus parazita roda Plasmodium
Poznato je preko 250 vrsta roda Plasmodium koje mogu parazitirati kod različitih životinja, uključujući primate, glodare, ptice i gmizavce. Uzročnici malarije čoveka su P. falciparum, P. malariae, P. vivax, P. ovale, a od nedavno je i zoonotska vrsta P. knowlesi, zbog pojava epidemija u JI Aziji, priznata kao peti izazivač malarije čoveka.
Životni ciklus roda Plasmodium sastoji se od seksualne i aseksualne faze. Seksualna faza, oplođenje i sporogonija, odvija se u vektoru, ženki anofeličnog komarca i traje 10 do 18 dana. Ženka polaže jaja na 2 do 3 dana za šta joj je neophodan krvni obrok. Nakon sporogonije pri sledećem krvnom obroku ženka inficira narednog domaćina, unoseći svojom salivom infektivne oblike sporozoite.
Aseksualna deoba, šizogonija, odvija se u organizmu čoveka i obuhvata ekstraeritrocitnu fazu u hepatocitima koja traje 5–15 dana, i eritrocitnu fazu.
Infekcija čoveka počinje ubodom ženke komarca roda Anopheles koja inokuliše sporozoite plazmodijuma iz svoje salive. Sporozoiti 30–40 minuta po inokulaciji ulaze u hepatocite gde se dele i diferenciraju u merozoite čiji broj varira u zavisnosti o vrste plazmodijuma i kreće se od 2000 (P. malariae) do 40.000 (P. falciparum). Prskanjem hepatocita dolazi do oslobađanja merozoita u krvotok.
Životni ciklusi vrsta roda Plasmodium se delimično razlikuju. Faza šizogonije u eritrocitu (Er) traje 48 sati kod P. vivax, P. falciparum i P. ovale, 72 sata kod P. malariae, a 24 sata kod P. knowlesi. Merozoiti prodrli u Er koriste hemoglobin (Hgb) domaćina za svoje preživljavanje. Formiraju najpre mlade trofozoite prstenastog oblika, a potom zrele trofozoite, koji se razvijaju u mlade, a potom u zrele šizonte. Zreli šizonti ispunjeni merozoitima dovode do prskanja Er, što za posledicu ima anemiju, a oslobođeni merozoiti inficiraju nove Er.
U toku aseksualne reprodukcije, posle nekoliko generacija merozoita, pojedini paraziti se konvertuju u seksualne forme, muške i ženske gametocite, čiji život traje nekoliko dana. Stvaranje gametocita nije obavezno, čak ni u slučaju kada se bolesnik ne leči. Broj gametocita u perifernoj krvi nije uvek u srazmeri sa brojem aseksualnih parazita. S obzirom na to da su gametociti odgovorni za pojavu i održavanje transmisije plazmodijuma, njihova brojnost i sposobnost da inficiraju komarca vrlo je važan faktor u epidemiologiji malarije.
Kliničke karakteristike malarije
Prijemčivost čoveka za nastanak infekcije plazmodijumom i razvoj bolesti je različita. Kod srpaste anemije postoji otpornost na malariju, odsustvo Duffy antigena na Er u izvesnoj meri štiti od P. vivax malarije, dok stanovnici malaričnih područja stiču imunitet. U trudnoći, koja je inače praćena stanjem fiziološke imunosupresije, malarija se ispoljava težom kliničkom slikom, anemijom majke, mogućom (kongenitalnom) transplacentarnom infekcijom ploda i prevremenim porođajem.
Klinička slika malarije i farmakološka efikasnost antimalarika povezani su sa vrstom roda Plasmodium i kompleksnim životnim ciklusom u organizmu čoveka.
Inkubacija obuhvata vreme od uboda komarca do početka ispoljavanja bolesti i varira od 7 do 30 dana, ali i znatno duže. Najkraća inkubacija, sa retkim izuzecima, vezuje se za P. falciparum, dok P. malariaemože imati dugu inkubaciju, merenu i decenijama.
Malarični napad predstavlja skup paroksizama između kojih se javljaju kraći ili duži afebrilni intervali. Paroksizmi su posledica istovremenog prskanja velikog broja Er i oslobađanja merozoita u krv. Klasičan paroksizam obuhvata „hladni” stadijum (traje 15–60 minuta, manifestuje se osećajem hladnoće, jeze i drhtavice), „vreli” stadijum (traje dva do tri sata, manifestuje se skokom temperature i preko 40° C, glavoboljom, povraćanjem), i stadijum znojenja, kada se profuznim znojenjem temperatura naglo vraća na normalu. Sledi opšta malaksalost i potreba za snom nakon čega se oboleli oseća dobro.
Simptomi su posledica oslobođenih parazitskih toksina koji indukuju makrofage na produkciju citokina. Simptomatologija malarije je na početku infekcije nespecifična i uobičajeno se ispoljava simptomima sličnim influenci što otežava kliničko prepoznavanje. U početku ruptura inficiranih Er nije sinhronizovana, ali se posle nekoliko dana uspostavlja sinhronizacija što se manifestuje intermitentnom febrilnošću na 24, 48 ili 72 sata, zavisno od vrste. P. vivax i P. ovale parazitiraju samo u mladim Er, čije je učešće u populaciji Er 2%, te je teorijski maksimum nivoa parazitemije 2%. P. malariae parazitira u starim Er kojih ima 1–2% te je i kod ove vrste maksimalni nivo parazitemije 2%, ali najčešće ispod toga, uobičajeno do 5000 parazita/µL (par/ µL) krvi. Najmalignija vrsta, P. falciparum, parazitira u svim stadijumima Er, te parazitemija može dostići i do 40–50%. Ciklus aseksualnog umnožavanja P. knowlesi traje svega 24 sata što za posledicu ima visoku parazitemiju.
Najveći broj slučajeva malarije se klasifikuje kao umerena ili nekomplikovana malarija. Međutim, malarija može dovesti do anemije, splenomegalije, trombocitopenije, blage žutice, uvećane jetre, ubrzanog disanja ali i težih komplikacija i smrtnog ishoda.
Ako se pojave simptomi multiorganskog oštećenja, uz parazitemiju preko 5%, malarija se smatra teškom. Ovo se posebno često dešava kod P. falciparum malarije, gde u kratkom periodu može doći do ozbiljnih oštećenja organa kada se razvijaju cerebralna malarija i koma, akutno oštećenje bubrega, edem pluća, akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), žutica, dijareja, kardiovaskularni kolaps i šok, teška anemija, hemoglobinurija, metabolička acidoza i abnormalna koagulacija /trombocitopenija. P. falciparum je odgovoran za većinu smrtnih slučajeva. Kod ove vrste šizogonija se odvija u krvnim sudovima unutrašnjih organa. Visoka parazitemija može dovesti do teške anemije. Na površini Er inficiranih ovom vrstom stvaraju se „ispupčenja”, koja čine proteini bogati histidinom, kojima se Er vezuju za vaskularni endotel i za druge Er. Grupisane ćelije dovode do adherencije Er za endotelne ćelije što izaziva poremećaj mikrocirkulacije, uzrokujući mikrotromboze, a potom i nekroze, dovodeći do oštećenja mozga (cerebralna malarija), bubrega i drugih organa.
Iako P. vivax retko daje komplikacije, one se mogu javiti (ARDS, ruptura slezine, cerebralna malarija) i završiti fatalno, što uz mogućnost relapsa i porasta rezistencije na glavne antimalarike ovu vrstu čini vrlo aktuelnom.
- ovaleretko izaziva ozbiljne komplikacije u vidu rupture slezine, teške anemije i ARDS-a.
Kliničke manifestacije izazvane vrstom P. knowlesi, koji može dostići visoku parazitemiju i do 27%, variraju od umerenih do teških, a bolest se može završiti spontanim izlečenjem, ali i fatalno. Kod febrilnih povratnika iz šumskih pojaseva JI Azije klinička sumnja na P. knowlesi postavlja se na osnovu teže kliničke slike i više parazitemije nego što se očekuje kod P. malariae, temperaturnih skokova na 24 sata i prisustvom atipičnih oblika plazmodijuma.
S druge strane, iako su slučajevi P. vivax i P. ovale malarije uopšteno govoreći benigniji, obe ove vrste plazmodijuma mogu u hepatocitima formirati uspavane forme, tzv. hipnozoite, koji osim primarne infekcije (obično unutar 2–3 meseca od infekcije) mogu i mesecima ili godinama kasnije dovesti do recidiva (ponovne pojave bolesti). Ova vrsta recidiva označava se kao relaps i predstavlja epizodu infekcije koja nastaje posle prolaska kompletne eritrocitne faze, ulaskom u cirkulaciju dotad uspavanih parazita preeritrocitne faze. Novija istraživanja pokazala su da P. ovale daje relapse češće nego što se ranije mislilo, i to u periodu između 2 meseca i 2 godine nakon inicijalne infekcije. Hipnozoiti se ne nalaze u razvoju P. falciparum i P. malariae. Međutim, kod P. falciparum infekcije, mogući su takođe recidivi koji se označavaju kao rekrudescencije, koje predstavljaju pogoršanje simptoma kod bolesnika kod kojih je u krvi zaostao nizak nivo parazita, što klinički i parazitološki nije bilo uočljivo. Za P. malariaekarakteristično je da submikroskopska infekcija može perzistirati decenijama.
Među hematološko-biohemijskim parametrima najznačajniji indikator malarije je trombocitopenija koja se detektuje kod blizu polovine obolelih. Značajan podatak je i porast laktat dehidrogenaze (LDH), dok je broj Er na početku infekcije nepromenjen.
Laboratorijska dijagnostika malarije
Brza i pouzdana dijagnoza su ključne reči za svaki suspektan slučaj malarije. Rana dijagnoza je osnov uspešne terapije i prevencije teških komplikacija. Tačno određivanje vrsta Plasmodium-a čini osnovu za primenu odgovarajuće terapije. Kod malarije, naročito izazvane P. falciparum-om, značajno je određivanje i praćenje nivoa parazitemije kao indikatora težine bolesti i uspešnosti primenjene terapije.
Cilj svih dijagnostičkih metoda je detekcija parazita u perifernoj krvi. Njihova uspešnost zavisi od vrste plazmodijuma, nivoa parazitemije, hemioprofilakse, započete terapije, prisustva gametocita, imuniteta domaćina, kao i kvaliteta testova. Dijagnostika malarije uključuje mikroskopiju, brze dijagnostičke testove (rapid diagnostic test – RDT), serologiju i molekularne metode zasnovane na reakciji lančane polimerizacije (polymerase chain reaction – PCR).
Do nedavno, mikroskopija je bila jedino dostupna metoda. Iako predstavlja zlatni standard u dijagnostici malarije, ima i brojne nedostatke. Pre svega, zahteva iskusnog parazitologa. Osim tehničkih ograničenja, različiti činioci kao što su niska parazitemija, mešane infekcije sa dominacijom jedne vrste, asimptomatske infekcije imunizovane populacije sa niskom parazitemijom i već započeto lečenje ili subdoziranje lekova, mogu otežati mikroskopsku dijagnostiku. Stoga se radi pouzdanije dijagnostike poslednjih godina intenzivno razvijaju i unapređuju brzi testovi i molekularne metode.
- Mikroskopija
Tehnika mikroskopskog pregleda razmaza periferne krvi i dalje predstavlja zlatni standard u dijagnostici malarije. To je relativno brza i jeftina metoda, čija osetljivost i specifičnost zavise od kvaliteta uzorka i bojenja i veštine parazitologa. Prag osetljivosti mikroskopskog pregleda je 50–500 (prosečno 100), a u najboljim svetskim laboratorijama i samo 5–20 par/μL krvi. Potrebno je pregledati 200–500 vidnih polja pre nego što se uzorak proglasi negativnim. Nedostaci mikroskopije su objektivna nedetektabilnost niskih parazitemija (submikroskopska malarija – SMM), nepouzdano određivanje vrste (morfološka sličnost pojedinih vrsta i stadijuma parazita, varijacije unutar vrsta, izmenjena morfologija parazita nakon započete terapije, loš kvalitet razmaza i/ili bojenja), teško uočavanje manje zastupljene vrste u mešanim infekcijama, nedetektabilna parazitemija usled sekvestracije P. falciparum, kao i lažna pozitivnost nakon terapije (mikroskopski vidljivi, ali oštećeni paraziti). Još od ranije poznato je da se bojenjem gustih kapi u toku ispiranja izgubi 60–90% parazita, što je poseban problem kod niskih parazitemija.
Paraziti malarije vizuelizuju se mikroskopskim pregledom bojenih gustih kapi i krvnih razmaza. Bojenje preparata vrši se različitim tehnikama bojenja, a vreme bojenja zavisi od boje – za bojenje po Gimzi 20 do 30 minuta. Mikroskopskim pregledom se određuju vrsta roda Plasmodium, stadijum parazita i nivo parazitemije, što su značajni parametri u izboru terapije. Vrsta se određuje na osnovu veličine i oblika parazitiranih Er i morfologije plazmodijuma. Mikroskopskim pregledom se može uočiti parazitski pigment fagocitovan od strane leukocita (Le) i time proceniti težina bolesti. Preparati se mogu godinama čuvati što omogućava kasniju kontrolu, kao i edukaciju kadrova.
Mikroskopija je još uvek metoda izbora kod akutne malarije. Dužina mikroskopiranja zavisi od nivoa parazitemije i iskustva parazitologa. Kod niske parazitemije (< 100 par/ μL krvi) neophodna je duža mikroskopija, u trajanju od bar 10–15 minuta pre nego što se preparat proglasi negativnim. Metoda zahteva veliki angažman i stručnost parazitologa i otuda je izrazito subjektivna.
Mikroskopija pojedinačnog uzorka obuhvata pregled po tri guste kapi i tri razmaza periferne krvi kod svih bolesnika suspektnih na malariju na prijemu. Ako se malarija mikroskopski potvrdi, ispituju se uzastopni uzorci u cilju praćenja parazitemije, tj. efekata primenjene terapije. Kod bolesnika kod kojih se pri prvom mikroskopskom pregledu ne uoče plazmodijumi, mikroskopski pregled se ponavlja još najmanje dva puta pre isključivanja dijagnoze malarije.
Niska parazitemija se očekuje na početku infekcije, kod bolesnika koji su koristili hemioprofilaksu, kao i kod stanovništva endemskih područja. Određivanje parazitemije je subjektivan postupak i koji god metod da se izabere moguće su greške, koje mogu biti sistemske ili slučajne. Sistemske greške su greške tehničkog osoblja i ogledaju se u vidu previše ili neadekvatno nanete krvi na pločicu, loše načinjenog krvnog razmaza kada su paraziti neravnomerno razmešteni u pretankom razmazu, ili zaklonjeni i teško uočljivi u debelom krvnom razmazu, ili lošeg bojenja. Takođe, različiti parazitolozi imaju različite individualne sposobnosti za precizno uočavanje i brojanje prisutnih parazita. Greške su najčešće kod niskih gustina parazita, blizu granice detekcije. Otuda do grešaka najčešće i dolazi na početku i na kraju praćenja parazitemije, kada je ona i najniža.
Uzorkovanje, bojenje i mikroskopija gustih kapi i razmaza periferne krvi
a) Priprema predmetnih stakala
Pre upotrebe predmetna stakla za pravljenje gustih kapi i krvnih razmaza se obezmašćuju potapanjem u hrom sumpornu kiselinu tokom 24 h, a po ispiranju vodom i nakon sušenja, stakalca se kratko potapaju u 70% alkohol, nakon čega se pojedinačno posuše i glancaju čistom pamučnom krpom.
- b) Pravljenje gustih kapi i razmaza periferne krvi
Pri uzorkovanju se obavezno nošene zaštitne rukavice za jednokratnu upotrebu i maska za lice. Jagodica domalog ili srednjeg prsta se dezinfikuje tupferom vate natopljenim 70% alkoholom. Prva kap, nakon uboda lancetom, odstranjuje se suvim delom tupfera vate, da bi se odstranio preostali alkohol. Pravi se pet gustih kapi i pet razmaza periferne krvi. Guste kapi se prave nanošenjem dve do tri kapi krvi na sredinu pločice. Uglom druge pločice krv se širi u homogenu, ovalnu mrlju (oko 1 x 2 cm) odgovarajuće gustine da ne bi „spala” u postupku bojenja i ispiranja. Krvni razmazi se prave nanošenjem male kapi krvi na terminalni deo pločice. Zatim se drugom pločicom, pod uglom od 45°, kap krvi razvlači naglim pokretom, tako da krvni razmazi budu što tanji, tj. da u što većem delu razmaza Er budu poređani jedan do drugog, a ne preklopljeni. Guste kapi i krvni razmazi se potom suše na sobnoj temperaturi najmanje 30 minuta, optimalno 1 h, pri čemu se vodi računa da budu zaštićeni od komaraca. Po tri guste kapi i tri krvna razmaza se boje, dok po dva uzorka služe kao rezervni uzorci u slučaju neuspelog bojenja ili kod dijagnostičkih dilema.
- v) Bojenje gustih kapi i krvnih razmaza po Gimzi
Guste kapi se ne fiksiraju da bi došlo do hemolize Er i oslobađanja parazita, dok se krvni razmazi fiksiraju metil alkoholom da ne bi došlo do hemolize. Nakon toga se razmazi i guste kapi boje 10% radnim rastvorom Gimze. Svaka pločica se prelije sa 5 mL radnog rastvora Gimze. Posle 30 minuta boja se lagano odlije, a preparati pažljivo ispiraju pod slabim mlazom tekuće vode. Potom se u vertikalnom položaju suše na sobnoj temperaturi.
- g) Mikroskopija gustih kapi i krvnih razmaza
Mikroskopija obojenih preparata se vrši na uveličanju x 1000 (u imerzionom sistemu mikroskopiranja). Prvo se obavlja pregled gustih kapi da se uoči eventualno prisustvo plazmodijuma, a potom se obavezno, nezavisno od rezultata mikroskopije gustih kapi, pregledaju i razmazi periferne krvi. Uzorci su proglašavaju negativnim nakon najmanje 30 minuta mikroskopiranja, odnosno pregledom ≥ 500 vidnih polja. Ukoliko postoje dijagnostičke dileme (artefakti koji liče na plazmodijume, započeta terapija antimalaricima koja je uslovila redukciju broja i/ili izmenjena morfologija plazmodijuma) boje se i mikroskopiraju i rezervni preparati.
Vrsta plazmodijuma određuje se pregledom razmaza periferne krvi na osnovu morfologije različitih stadijuma parazita i morfologije parazitiranih Er (46,47).
Sem vrste, evidentraju se i uočeni stadijumi parazita, prisustvo poluraspadnutih parazita, kao i prisustvo parazitskog pigmenta u Le. Vrši se i semikvantifikacija gametocita skorovanjem i to tako da se nalaz 1–10 gametocita u 100 vidnih polja skoruje kao retki gametociti (+), nalaz 11–100 parazita u 100 vidnih polja kao umereno prisutni (++), a ukoliko je u jednom vidnom polju uočeno > 1 gametocita nalaz se skoruje kao brojni gametociti (+++).
- d) Određivanje parazitemije plazmodijuma
Parazitemija se izražava kao procenat (%) Er parazitiranih aseksualnim stadijumima Plasmodium-a, što je rutinski metod za neendemska područja. U 10 vidnih polja razmaza periferne krvi pod imerzijom broje se parazitirani Er (nezavisno od broja parazita u jednom Er) i ukupan broj Er. Parazitemija se izračunava prema formuli: % (P) = N/M x 100 (P – parazitemija, N – srednja vrednost broja parazitiranih Er i M – srednji broj Er u vidnom polju).
- Brzi antigenski testovi
U cilju eliminisanja nedostataka mikroskopije SZO promoviše primenu brzih testova. Brzi testovi su imunohromatografski testovi kojima se detektuju parazitski antigeni u krvi. Prednost je brzo dobijanje rezultata (15–20 minuta), jednostavnost izvođenja i očitavanja. Kao ciljni antigeni koriste se histidinom obogaćeni protein 2 (HRP2) specifičan za P. falciparum, panspecifična Plasmodium aldolaza zajednička za sve četiri glavne vrste plazmodijuma i parazitska laktat dehidrogenaza (pLDH) koja može biti panspecifična, zajednička za sve četiri vrste ili specifična za pojedine vrste roda Plasmodium. pLDH luče samo vijabilni plazmodijumi, što je korisno za praćenje efikasnosti terapije. Nedostaci brzih testova su visok prag osetljivosti od 50 par/μL, ograničena detekcija mešanih infekcija, nemogućnost određivanja parazitemije i dugotrajno prisustvo HRP2 antigena u krvi što onemogućava praćenje efikasnosti terapije. Postoje brojni brzi testovi, a SZO prati njihove performanse i objavljuje rezultate analiza.
- Serologija
Indirektan pristup u otkrivanju infekcije zasniva se na detekciji specifičnih antitela plazmodijuma serološkim metodama kojima se može pratiti izloženost parazitima malarije i potvrditi ranija infekcija. Sa manjim ili većim uspehom u primeni su test indirektne imunofluorescencije (IIF), test indirektne hemaglutinacije (IHA) i imuno-enzimske metode (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA), kojima se dokazuju specifična IgG antitela. Otuda serološke metode ne služe za detekciju akutne infekcije, jer se antitela razvijaju tek nakon 10–14 dana, ali su veoma korisne u epidemiološkim istraživanjima, kao i u transfuziologiji, za skrining davalaca krvi.
- Molekularna dijagnostika malarije
Devedesetih godina prošlog veka započeto je uvođenje molekularnih metoda zasnovanih na PCR-u za detekciju specifičnih sekvenci DNK plazmodijuma iz pune krvi. Ove metode su visoko specifične i osetljive, jer omogućuju detekciju 1–5 parazita na μL krvi, kao i genotipizaciju. Kvalitativnim PCR-om je povećana osetljivost u odnosu na mikroskopski pregled i do 100 puta, dok je daljim razvojem uvedena i kvantitativna dijagnostika, a unapređeni su i identifikacija vrsta roda Plasmodium i detekcija mešanih infekcija.
Značajan napredak u razvoju metoda zasnovanih na PCR-u predstavljalo je uvođenje kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu tj. qPCR (quantitative real-time polymerase chain reaction). qPCR daje informacije o količini DNK prisutnoj u uzorku. U dijagnostici malarije, qPCR se primenjuje i kao skrining test za detekciju roda Plasmodium, i kao specijes-specifični qPCR za detekciju vrsta rodaPlasmodium. Prednost PCR tehnika u dijagnostici malarije je mogućnost detekcije niske parazitemije.
Visoka osetljivost PCR-a pomaže i kod pacijenata koji su započeli terapiju pre dijagnostike, te su paraziti morfološki izmenjeni ili vrlo retki, kao i u otkrivanju P. falciparum pri sekvestraciji, kada se mali broj parazita oslobađa u cirkulaciju. Molekularnim metodama je posebno unapređena dijagnostika mešanih infekcija, što je vrlo bitno, jer izostanak detekcije manje zastupljene vrste može značajno uticati na tok bolesti, naročito ako je to P. falciparum. Primenom PCR-a se prevazilazi problem morfološke sličnosti P. vivax i P. ovale koja dovodi do česte zamene ovih vrsta mikroskopskim pregledom. Konačno, molekularna dijagnostika je praktično jedini način da se potencijalno fatalna P. knowlesi malarija diferencira od ostalih vrsta. Sem kliničke primene, PCR metode su našle mesto i u epidemiologiji, u istraživanjima vakcina i novih antimalarika. U kliničkoj dijagnostici i referentnim laboratorijama qPCR je metoda izbora, naročito u razvijenim zemljama gde se optimizuju brojni protokoli. Za svega nekoliko godina od uvođenja PCR tehnologije u detekciju malarije izvršena su brojna istraživanja kojima se različitim qPCR protokolima pokušava unaprediti specifičnost i osetljivost u detekciji i određivanju vrste plazmodijuma.
Ograničenja PCR metoda predstavljaju rizik od kontaminacije, naročito u laboratorijama u kojima se ova dijagnostika vrši svakodnevno, kao i zahtev za skupom opremom i reagensima i posebnim laboratorijskim uslovima, koji uglavnom nedostaju u endemskim područjima. Molekularna dijagnostika se međutim intenzivno uvodi u neendemska područja za dijagnostiku importovane malarije, posebno u laboratorije gde se malarija retko dijagnostikuje te parazitolozi ređe imaju prilike za sticanje iskustva.
Nedostaci konvencionalne dijagnostike, ilustrovani slučajevima SMM, zahtevaju uvođenje molekularne dijagnostike u rutinsku praksu da bi se povećala dijagnostička osetljivost kod pacijenata sa niskom parazitemijom, tačno odredila vrsta, i u skladu s tim primenila terapija, kao i da bi se u asimptomatskoj kategoriji putnika prepoznali nosioci retkih Plasmodium spp. u cilju prevencije ponovnog uspostavljanja transmisije. Danas je state-of-the-art metoda u ovom smislu qPCR, i to i za postavljanje dijagnoze i za potvrdu dijagnoze do nivoa vrste, ali još uvek nedostaju validne kliničke studije o upotrebljivosti i korisnosti u praćenju efekta terapije.
U cilju unapređenja dijagnostike malarije u našoj zemlji sprovedena je kohortna studija koja je obuhvatila sve putnike koji su se u periodu od jula 2010. do maja 2013. godine nakon povratka iz područja endemskih za malariju javili na Kliniku za infektivne i tropske bolesti radi isključivanja ove infekcije, a kod kojih je dijagnoza malarije potvrđena ili isključena uporednom primenom referentnih metoda konvencionalne dijagnostike malarije i novo uvedenih metoda molekularne dijagnostike. Konvencionalna dijagnostika malarije obavljana je na Odseku za parazitologiju Službe za mikrobiologiju KCS, a molekularna dijagnostika u Laboratoriji za medicinsku parazitologiju Instituta za medicinska istraživanja Univerziteta u Beogradu, i to:
a) Kvantitativni real-time PCR za detekciju roda Plasmodium (skrining qPCR)
- b) Kvantitativni real-time PCRza detekciju vrsta roda Plasmodium(specijes-specifični qPCR).
Postupak sa obolelim, kontaktima i neposrednom okolinom
Prijava obolevanja od malarije vrši se prema Zakonu o zaštiti stanovništva od zaraznih bolesti („Sl. glasnik RS”, br. 15/2016) i Pravilniku o prijavljivanju zaraznih bolesti i drugih slučajeva utvrđenih Zakonom o zaštiti stanovništva od zaraznih bolesti („Sl. glasnik RS”, br. 98/05).
Lekar nadležnog doma zdravlja koji je dežuran u TPC-u dijagnostikuje i registruje sumnje/oboljenje od malarije i upisuje ga u Protokol registrovanih stanja koji se nalazi u TPC-u i obaveštava nadležni zavod za javno zdravlje o postojanju sumnje na malariju i upućuje osobu u najbliže odeljenje za infektivne bolesti zdravstvene ustanove. Podatke iz pomenutog Protokola prikupljaju članovi „Tima za nadzor populacije migranata” nadležnog I/ZJZ jednom nedeljno. Članovi Tima za nadzor populacije migranata nadležnog I/ZJZ pripremaju izveštaj o Registrovanim stanjima u skladu sa obrascem Izveštaja o broju, vrsti pruženih zdravstvenih usluga i preduzetim merama u zdravstvenim ustanovama prema migrantima, tražiocima azila i azilantima.
Podaci se u zdravstvenim ustanovama, i centrima za azile unose u predefinisane word obrasce i nakon isteka posmatranog perioda (nedelje) dostavljaju nadležnom zavodu/institutu za javno zdravlje u elektronskom formatu sa obeleženim nazivom zdravstvene ustanove, prihvatnog centra i centra za azil i datumom. Nadležni zavod/institut je u obavezi da unese podatke iz prikupljenih obrazaca u aplikaciju za unos podataka za koju ćemo vam pristupne podatke i uputstvo za korišćenje blagovremeno dostaviti. Rok za unos podataka u zavodu/institutu za prethodnu nedelju je ponedeljak u 14:00 časova.
Lekar (infektolog) koji na osnovu kliničke slike postavlja sumnju na obolevanje od malarije u koordinaciji sa teritorijalno nadležnim ZJZ/IJZ šalje uzorak na laboratorijsko ispitivanje. Istovremeno teritorijalno nadležnom ZJZ/IJZ dostavlja pojedinačnu prijavu sumnje na obolevanje od malarije. Laboratorija rezultate laboratorijske analize dostavlja lekaru koji je uputio uzorak, teritorijalno nadležnom ZZJZ/IZJZ i IZJZ Srbije.
Po dobijanju pojedinačne prijave sumnje, epidemiolog teritorijalno nadležnog ZZJZ/IZJZ sprovodi epidemiološko ispitivanje i istraživanje radi utvrđivanja faktora koji su doprineli nastanku zarazne bolesti i/ili njenom prenošenju i pisanu Informaciju dostavlja IZJZ elektronskim putem na adresu: [email protected].
Konačno postavljena dijagnoza obolevanja od malarije prijavljuje se podnošenjem pojedinačne prijave na obrascu br. 1 u skladu sa Pravilnikom o prijavljivanju zaraznih bolesti i drugih slučajeva utvrđenih Zakonom o zaštiti stanovništva od zaraznih bolesti, („Sl. glasnik RS”, br. 98/05).
Sumnje/infekcije koja se registruju kod izbeglica/migranata koji su izmakli epidemiološkom nadzoru u TPC-u, a evidentirani su u službi opšte medicine, službi zaštite zdravlja školske dece i omladine, hitnoj pomoći ili službama i ustanovama koje su teritorijalno dislocirane kao, ambulante, ili zdravstvene stanice u selima i delovima grada ili ambulantama na teritoriji nadležnih I/ZJZ takođe se prikazuju kroz nedeljni Izveštaj koji priprema nadležni I/ZJZ.
IJZ Srbije priprema nedeljne izveštaje i dostavlja ih Ministarstvu zdravlja i nadležnim I/ZJZ.
Izolacija. Kod hospitalizovanih bolesnika mere predostrožnosti koje se sprovode sa krvlju. Od sutona do zore oboleli moraju biti okruženi mrežom protiv komaraca.
Dezinsekcija u toku bolesti. Ne.
Karantin. Ne
Imunizacija kontakata. Ne
Ispitivanje – traženje kontakata i izvora infekcije. Utvrditi istoriju prethodne infekcije ili moguće ekspozicije. Ukoliko se u anamnezi utvrdi zajedničko korišćenje igala, izvršiti ispitivanje, aktivno traženje lica koja su ih koristila i preduzeti njihovo lečenje.
Protivepidemijske mere
Utvrditi prirodu i veličinu epidemije. Intenzivno aktivno otkrivanje obolelih i mere suzbijanja komaraca, odraslih i njihovih larvi, eliminacija staništa komaraca, lečenje akutno obolelih. Korišćenje ličnih zaštitnih sredstava i supresivnih lekova. Razmotriti potrebu masovnog lečenja.
DEFINICIJA SLUČAJA MALARIJE (Plasmodium spp.)
Klinički kriterijumi
Svaka osoba sa groznicom ili istorijom bolesti da je imala groznicu.
Laboratorijski kriterijumi
Najmanje jedan od tri navedena:
– Detekcija parazita malarije svetlosnim mikroskopom u krvnom razmazu
– Otkrivanje nukleinske kiseline Plasmodium-a u krvi
– Detekcija Plasmodium antigena
Izvršiti diferencijaciju Plasmodium spp. ako je to moguće
Epidemiološki kriterijumi
- P. (ne primenjuje se)
Klasifikacija slučaja
A. Mogući N. P.
- Verovatan N. P.
- Potvrđeni slučaj (svako lice koje ispunjava kliničke i laboratorijske kriterijume).
Reference:
- http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs094/en/
- Zorica Dakić, doktorska disertacija: Značaj molekularne dijagnostike u evaluaciji kliničkog toka i ishoda malarije, 2015.UDK broj: 577.21:616.936 078(043.3)https://fedorabg.bg.ac.rs/fedora/get/o:10953/bdef:Content/get
- http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2012:262:0001:0057:EN:PDF
Uputstvo sačinili:
Institut za javno zdravlje Srbije „Dr Milan Jovanović Batut”
Centar za kontrolu i prevenciju bolesti
Centar za mikrobiologiju
u saradnji sa Klinikom za infektivne i tropske bolesti Kliničkog centra Srbije
Izvor: IZJZS Batut
