CRISPR: Skoro neizgovorljivo otkriće veka o kojem svi govore. Jednostavnom Google pretragom dobićete preko 4 miliona rezultata vezana za CRISPR. Osim toga, postoji velika šansa da će se ova skraćenica uskoro pojaviti u Nobelovoj nagradi. A da li znate zašto je to tako relevantno otkriće? Da li znate da je u toku ogromna borba oko CRISPR patenata? I još bolje, da li ste znali da bi se tok ovog patentnog rata mogao potpuno promeniti usled endonukleaze po imenu Cpf1?
Verovatno su mnogi uplašeni zbog mogućnosti genetske manipulacije na ljudima. Međutim, kada pročitate kako bi se CRISPR tehnologija mogla koristi za lečenje raka, dece sa anemijom srpastih ćelija ili osoba sa Hantingtonovom bolesti, kao i stotine drugih genetskih bolesti, zamenom abnormalnog gena koji uzrokuju ove bolesti sa „dobrim“ genom, sasvim je normalno da se predomislite.
Na samom početku 1990-ih u Španiji, Francisco Mojica i njegova grupa, proučavali su kako bi se archaea prilagodila i preživela u izuzetno slanom okruženju. Kada su analizirali hromozomski region za koji su mislili da može imati veze sa ovom adaptacijom, primetili su veoma specifičnu genomsku strukturu koja im je privukla pažnju: informacija koja se ponavlja nekoliko puta, kao zebrasti pešački prelaz. U 2003. godini, otkrili su da ove sekvence predstavljaju stečeni imuni sistem koji je omogućio ovim mikroorganizmima da se bore protiv napadača, kao što su virusi. Trik ovog imunog sistema, prisutan kod archaea kao i drugih bakterija je u tome što omogućava virusnoj DNK da se integriše u hromozom i koristi ga kao bar kod da prepozna i da se bori protiv onog virusa čiji je DNK „ukraden“ prvobitno.
Ali kako to genomske sekvence rade kao oružje za odbranu? Kada archaea i bakterije pretrpe virusni napad, one otkriju nepoznatu DNK koja bude ubrizgana u ćeliju i integrišu njene kratke delove u CRISPR lokus u njihovom hromozomu. Ova integracija se ne dešava slučajno, već specifično, kao „prostor“ između kratkih palindromskih ponavljanja. Interesantna stvar koju možete da imate na umu o palindromskoj sekvenci je da, kada je izražena na jedan lanac RNK , ona će se saviti na sebe i može da posluži kao neka vrsta drške koju proteini mogu da zgrabe, kao u slučaju Cas endonukleaze.
Ti strani delići DNK se dalje nasleđuju kroz deobu ćelija i nakon druge virusne infekcije su transkribovane na komade RNK koji se naknadno koriste zajedno sa Cas proteinima da bi se formirao kompleks interferencije. Ovaj kompleks koristi informacije u ovim RNK molekulima da bi se spario sa odgovarajućim sekvencama u virusnom DNK i CAS proteinu, koji se uhvati za ove RNK , a zatim razgrađuje virusni DNK i na taj način sprečava infekciju da se desi.
Pored ovog mehanizma, ono što je neverovatno za CRISPR je da se elementi ovog sistema mogu preneti na bilo koju ćeliju, uključujući humane ćelije. Svrha ovog prenosa je da ovaj sistem može biti programiran da preseče gde god želimo da se preseče, što znači da možemo menjati informacije genoma. Kada se jednom preseče, DNK sistem za popravku ćelija pokušava da ga popravi i to radi uvodeći izmene. Štaviše, ove modifikacije ili promene koje se mogu pojaviti nasumično, mogu biti usmerena uvođenjem obrasca. Drugim rečima, mi ćemo govoriti ćeliji: „Vidi, biće reza u tvojoj DNK ovde i ti ćeš koristiti ovu informaciju koji ti dajem da uvedeš novu informaciju na tom mestu“.
Promenom genetske informacije bilo koje žive ćelije, možemo proučavati njenu funkciju, reprodukovati genetske defekte kod miševa i pokušati da pronađemo lekove protiv njih. Takođe, u mnogo futurističkoj primeni, možemo modifikovati genetske aberacije direktno kod ljudi, na primer da eliminišemo virusne informacije koje se zadrže u našim ćelijama nakon virusne infekcije, kao što su AIDS ili herpes virus, čime iskorenjujemo infekciju i čak sprečavamo ćeliju da se zarazi.
Jennifer Doudna, istraživač sa Berklija, želela je da razume kako se RNK molekuli koriste se za regulaciju ekspresije proteina iz genoma. I tako je CRISPR sistem je izgledao kao veoma dobar primer za to. U 2011. godini, započela je saradnju sa mikrobiolog Emmanuelle Charpentier, sa Max Planck Instituta za infektivnu biologiju, koji je bio zainteresovan za bakterije koje su ljudski patogeni, naročito za Streptococcus piogenes. Ono što je zanimljivo kod ove bakterije je da ima sistem CRISPR i da ima jedan gen koji kodira protein poznat kao Cas9, za koji je genetski poznato da će biti neophodan u CRISPR sistemu, iako niko nije znao šta je funkcija tog proteina u to vreme. Tako su zajedno počeli da ga testiraju. Oni su utvrdili da Cas9 ima mogućnost interakcije sa DNK, da generiše dvostruko – lančani prekid u DNK u sekvencama koje odgovaraju sekvenci u vodećem RNK (crRNA). Osim toga, ovaj vodeći RNK se sparuje sa drugom RNK pod nazivom „tragač RNK“ ( tracrRNA ) formirajući strukturu koja regrutuje Cas9 protein. Dakle, te dve RNK i jedan protein su ono što je u prirodi potrebno da se prepozna i uništi virusna DNK u cilju sprečavanja širenja infekcije.
Njihov najveći doprinos je u tome što su generisali jednostavniji CRISPR sistem povezujući dva molekula RNK i time dobili pojednostavljen sistem koji se sastoji od samo jednog vodećeg RNK i jednog DNK-rezača proteina. Drugim rečima, imaju enzim za DNK sečenje koji može biti programiran sa kratkim delom RNK da u osnovi rascepi svaku dvolančanu DNK sekvencu.
U 2013. godini, Feng Zhang sa Broad Instituta MIT i Harvarda, uspešno je adaptirao CRISPR – Cas9 sistem za uređivanje genoma u eukariotske ćelije (Cong et al., 2013). Zhang i njegov tim konstruisali su dva različita Cas9 ortologa (iz S. thermophilus i S. piogenes) i pokazala cepanje ciljanih genoma u ljudskim i ćelijama miševa.
O čemu je taj ceo patentni rat
Spor oko patenta započet je zbog novca. Prijava Jennifer Doudna za originalan patent je popunjena u martu 2013. godine, a Feng Zhang je popunio svoju u oktobru 2013. Iako je podneo kasnije, Zhang i Broad Institutu je odobreno više od deset CRISPR patenata za uređivanje genoma. ZAŠTO? Zato što je Zhang platio dodatno kako bi se ubrzalo ispitivanje primene njegovih ključnih patenata, te je dobio svoj prvi patent u aprilu 2014.
Univerzitet Kalifornije doveo je u pitanje odluku Sekretarijata za patente i trgovinu SAD-a, koji sada mora da odluči o ishodu ove bitke za patent vredne milijardu dolara, koja ima potencijal za uređivanje ljudskih genoma i lečenje genetskih bolesti. Advokati Univerziteta Kalifornije navode da Zhang „nikada nije imao ili koristio“ tracrRNA , koja je suštinska komponenta CRISPR – Cas9 sistema za obradu genoma u bilo kojim dostavljenim eksperimentalnim podacima i rezultatima. S druge strane, Broad advokati negiraju te „neosnovane“ optužbe i daju jedan važan argument: da se tvrdnje Univerziteta Kalifornija ne mogu patentirati, zato što precenjuju ono što je Doudna zapravo postigla.
Otkriće Cpf1
U septembru 2015, Feng Zhang, objavio je nalaz koji može da promeni ceo rat oko CRISPR patenta. Pokazalo se da je, osim Cas9, otkriveno novi protein koji može da izvrši izmenu gena, protein koji se zove Cpf1. S obzirom da Cpf1 odgovara novom proteinu DNK-rezanja, to je izvan obima CRISPR-Cas9 patenata.
Zhang i njegov tim otkrili su Cpf1 ispitivanjem hiljade CRISPR sistema u različitim bakterijama kako bi pronašli enzime koji se mogu koristiti u ljudskim ćelijama. Cpf1 je konačno pronađen u rodu Acidaminococcus i Lachnospiriceae. Nedavno otkriven CRISPR-Cpf1 sistem je nova klasa CRISPR sistema i u stanju je da preseče ciljni DNK supstrat u ljudskim ćelijama pod vođstvom crRNA. Štaviše, sam Cpf1 je sekvencno-specifični RNase, jedina otkrivena nukleaza koja ima obe nukleazne sekvencne specifičnosti i vijabilnost DNaze i RNaze.
Ovo otkriće je veoma važno za komercijalizaciju CRISPR tehnologije koja tek započinje, posebno za sledeće kompanije: vodeća kompanija Editas Medicine (povezan sa Zhangom), Doudnina biotehnologije Intellia i Charpentierova Crispr Therapeutics.
Najnovija otkrića Cpf1
U 2016. dve veoma važna publikacije o Cpf1 izašale su u Nature. Prva je otkrila detalje o njegovoj strukturi i mehanizmu, a takođe pruža strukturnu osnovu za njeno unapređenje, koja može da pomogne da Cpf1 sistem postane specifičan i efikasan novi sistem za uređivanje gena. Ovaj rad koristi biofizičku i strukturnu biologiju da otkrije detalje kako Cpf1 prepoznaje i obrađuje prekursor crRNA, a takođe ističe katalizatore i strukturnu fleksibilnost Cpf1. Cpf1 i crRNA mogu se posmatrati kao pravi par, pre i posle braka. Cpf1 je labava i fleksibilna konformacija, ali nakon kombinaciji sa crRNA, Cpf1 ima očigledne promene u konformaciji.
„Ljubavni element“ koji se nalazi između, kao što se vidi po strukturnim podacima, je (Mg(OH))2+ jon, sa veoma bitnom funkcijom koja stabilizuje konformacije crRNA i stimuliše aktiviranje Cpf1. Štaviše, može se direktno uključiti u katalitičku reakciju substrata. Ova zapažanja su potvrđena od strane moćnog biofizičkog metod po imenu Mikroskala termoforeze (MDT) koji može meriti interakcije molekula.
Druga publikacija se fokusira na crRNA obradu aktivnosti Cpf1 i pokazuje da je enzim, pored cepanje strane DNK, odgovoran za cepanje pre-crRNA. Osim toga, ova studija je identifikovala tri aminokiseline neophodne za obradu crRNA.
Nauka je, bez sumnje ušla u eru u kojoj novac i priznanje imaju moć nad naučnim otkrićima. Ono što je važno pored svih sukoba je to, da se bavimo dobrom naukom, da imamo neverovatne rezultate, da je budućnost je ovde i da treba da budemo informisani o takvim važnim naprednim otkrićima i njihovim primenama.
Izvor: LinkedIn
